Kaplı lam üzerine yapılmış olan kesitler en iyi sonuç için 1 gece bekletildikten sonra boyanmalıdır.

1) Kesitler 60°C lik etüvde 1 saat deparafinize edilmelidir.

2) Xylene içine alınan kesitler 2x5 dakika bekletilir.

3) Absolü alkol içine alınarak 10 ar kere batırılıp çıkarılır.

*** Opsiyonel olan Antigen Retrieval yapılmayacak ise 6 nolu aşamaya geçilir. Ama ben her kesite fiksasyonumuz ne kadar iyi olursa olsun Citrat Buffer ile antigen retrieval yapmayı önemle tavsiye ederim.

4) Distile su ile kesitler yıkanır.

5)Antigen Retrieval (Opsiyonel) ***

%10'luk Citrat Buffer solüsyonu hazırlanır. (Bu EDTA veya HCl de olabilir, işlemler aynıdır)

10 cc Citrate Buffer

90 cc Distile Su

Lamlar mikrodalga fırına dayanıklı plastik şale içine dizilir.

 Üzerine %10 luk Citrate Buffer solüsyonu konulur.

Yine mikrodalgaya dayanıklı bir kap içine su konulur ve bu kap içine antigen retrival yapılacak şale yerleştirilir.

Mikrodalga 5 dakika maksimum güçte (yaklaşık 800 watt) 'ta çalıştırılır.

Süre bitiminde fırının gücü %50 azaltılarak (yaklaşık 400 watt) 15 dakika daha çalıştırılır.

Süre bitiminde şale mikrodalga fırından dışarı çıkarılır ve dışarda 20 dakika bekletilir.

6) Distile su ile yıkanır.

7) %3'lük H2O2 (Hidrojen Peroksit) ile Peroksidaz blokajı yapılır. 20 dakika.

Hazırlanışı

3 cc H2O2

97 cc Distile su

Kesitler bu karışım içinde 20 dakika bekletilir.

8) Distile su ile kesitler yıkanır.

9) Kesitler PBS te 3x5 dakika bekletilir.

10) Protein Blokajı yapılır - 5 dakika.

11) Kesitlerin üzreindeki blokaj akıtılarak yıkanmadan, kesit üzerlerine ilgili primer antikordan eğer kullanıma hazır kullanıyorsak 2 veya 3 damla, konsantreden kendimiz hazırladıysak 100 mikro litre damlatılır ve primer antikorun süresi kadar bekletilir. (İdeal sonuç 30-60 dakika arasıdır).

13) Biotinylated Goat Anti-Polyvalent (Bu mouse veya Rabit'te olabilir ben her ikisinde de kulanılabilen Polyvalent formunu tercih ediyorum) solüsyonu yine kesitlerin üzerine 2-3 damla damlatılmak üzere 20 dakika bekletilir.

14) Kesitler PBS te 3x5 dakika bekletilir.

15) Streptavidin Peroksidas solüsyonunda yine kesitlerin üzerine 2-3 damla damlatılarak 20 dakika bekletilir.

16) Kesitler PBS te 3x5 dakika bekletilir.

17) DAB veya AEC kromojen'de 5 dakika bekletilir.

18) Musluk suyu ile kesitler iyice yıkanır.

19) Kesitlere Hematoksilen ile counter stain yapılır (yaklaşık 20 saniye).

20) Musluk suyu ile kesitler yıkanır.

21) Lityum karbonat ile hazırlanan doymuş çözeltide kesitlerin mavi renk alması sağlanır. Bu işlemi musluk suyu altında yıkayarak da sağlayabilirsiniz. Buradaki amaç süreyi kısaltmak ve suyu az kullanmak içindir.

22) Lityum karbonat içinde 10 dip yapılan kesitler tekrar musluk suyu ile yıkanır.

23) Eğer kromojen olarak AEC kullanılmış ile direkt olarak alkole girmeden sulu kapama malzemesi ile kesitler kapatılır. Unutmayın !!! Alkole girerseniz boyamanız kaybolur !

24) Eğer kromojen olarak DAB kullanılmış ise kesitler önce alkolden geçirilir, etüvde kurutulur ve ondan sonra entellan ile kapatılır.

 

PBS Hazırlanışı :

Na2HPO4 (diSodiumHidrogenPhosphate) - 3,710 gr

NaH2PO4 (SodiumdiHidrogenPhosphate) - 0,989 gr

NaCl (SodiumChloride) - 14,4 gr

Malzemeler 2 Litre Distile su içinde çözündürülür

 

Konsantre Buffer Hesabı

Elimizdeki 25X Buffer ile 200 ml 1X buffer solüsyon hazırlamak isteyelim.

200 x 1 = Konsantre Bufferdan Alınacak Miktar x 25

Konsantre Bufferdan Alınacak Miktar = 200 / 25

Konsantre Bufferdan Alınacak Miktar = 8 ml

yani toplam 200 ml solüsyon hazırlayacağımız için ;

8ml 25X bufferdan alıp üzerine 192 ml distile su ilave edeceğiz.