BOYANMA OLMAMASI

1) Yapılan kesitlerin iyi deparafinize edilmemesi :

Kesitlerin 60 derecede 1 saat veya 37 derecede overnight (birgece) bekletilmesi gerekir.

Etüvden alınan kesitlerin de bekletilmeden Xylene içine alınması gereklidir. Aksi takdirde etüvden alınan kesitlerin üzerindeki parafin tekrar donacağından boyanmanın olmamasını veya yeterli boyanmamanın sağlanamamasına neden olacaktır.

2) Xylenenin temiz olmaması :

Temiz olmayan bir Xylene, lam üzerindeki parafinin yeterli miktarda temizlenmemesine neden olacağından buna bağlı olarak boyanmanın sağlanamamasına neden olabilir.

3) Xylen'i takiben kullanılan Alkollerin temiz olmaması :

Yine aynı şekilde temiz olmayan Alkol, kesit üzerindeki Xylenin iyi temizlenmemesine ve buna bağlı olarak boyanmanın sağlanamamasına neden olabilir.

4) Kesit üzerine Primer antikorun damlatılmaması :

Kesit üzerine damlatılacak primer antikorun dalgınlıkla damlatılmaması sonucu da haliyle boyanma görülmez. Tabi bunun yanı sıra sekonder antikor veya streptavidin peroksidas veya kromojen aşamalarından birinin atlanması sonucu yine boyanma görülmez.

5) Primer antikordan sonra kullanılan sekonder antikorun primer ile uyumsuz olması :

Primer antikorumuz Mouse'tan elde edilmiş işe Mouse sekonder antikor, Rabit ise Rabit sekonder kullanılmalıdır. Bunun yanında bunların Polyvalent adı verilen ve her iki formda da çalışan türü de mevcuttur. Ben sizlere polyvalent kullanmanızı tavsiye ederim. Kitlerin çoğu bütün fimalarala çalışabilir. Ancak bazı firmalar sacede kendi kitleri ile çalışan primerler sattıklarından satın aldığınız firmaya elinizdeki kit ile çalışıp çalışmadığını sorunuz.

6) Kromojenin Alkol ile geçimsiz olması :

Örneğin kromojen olarak AEC kullanılıyor ise sulu kapama malzemesi ile kapatılması, bunun için ise kromojen aşamasından sonra Alkole girmemesi gerekmektedir. Aksi takdirde kromojen alkol içinde çözüneceğinden boyanma görülmez.

7) Ortam ısısının çok düşük olması :

İmmünhistokimya boyarken ortam ısının çok düşük olması solüsyonların dokuya olan penetrasyonlarını azaltacağından boyanmanın yeterli olmamasını sağlayabilir. Böyle durumda boyanmanın sağlanabilmesi için ortamı ısıtma imkanı yok ise boyanmayı arttırmak için boyama sürelerinin uzatılmasında fayda vardır.

8) Kullanılan antikorların sürelerinin dolmuş olması:

Kullandığımız malzemelerin sürelerin geçmiş olması boyanmanın az veya hiç olmamasına neden olabilir. Bu yüzden boyanma olmadığında kullanılan antikorun son kullanım tarihini kontrol edin.

9) Kullanılan antikorun herhangi bir ön işlem iştemesi :

Kullanılan antikor eğer kullanmadan önce Antigen Retrieval veya Proteaz,Tripsin enzimi vs. gibi ön işlemler istiyor ve biz bunu uygulamadıysak boyanma olmayabilir veya yeterli miktarda boyanma sağlayamayabiliriz. Ben immünhistokimya uygulanacak lamlara eğer özel başka bir ön işlem gerekmiyorsa Citrate Buffer ile antigen retrieval yapılmasını tavsiye ederim. Yani ön işlem gerektirmeyen antikorlara dahi Citrate Buffer ile antigen retrival yapılmasını tavsiye ediyorum. Böylece boyanma daha mükemmel olacaktır.

10) Seçilen antikorun dokuya uyumu:

Parafin dokuda çalışırken mutlaka parafin dokularda çalışan antikor kullanılmalıdır. Aksi takdirde boyanma olmayabilir.

Ayrıca Rat vs gibi deneysel çalışmalada kullanılan antikorun mutlaka çalıştığınız hayvan modelinde çalışıyor olması gerekir. Yani Rat için rat'ta çalıştığı test edilmiş antikor tercih edilmelidir.

 

ZEMİN BOYANMASI

1) Kesit için kullanılan lamların temiz olmaması.

2) Lam kaplamda kullanılan malzeme zemin boyanmasına neden olabilir.

Bunu önlemek için immünhistokimya boyanacak kesitlerin mutlaka üstü kapaklı boyama standlarında yapılması gereklidir.

Stand zeminine solüsyonların buharlaşmasını engellemek için mutlaka su konulmalıdır.

Herhangi bir aşamada kesit üzerindeki solüsyonun kuruduğu görülürse o kesit veya kesitler için boyama tekrarlanmalıdır.

4) Lamların boyama sırasında PBS ile iyi yıkanmamaları :

Bu en sık karşılan nedendir. Kesitler boyama aşamaları arasında PBS ile iyice yıkanmalıdır. Yıkamanın az olması zemindeki antikorların kesit üzeride kalmalarına neden olmakta ve bu da özellikle kromojen aşamasında zeminde istenmeyen boyanmaya neden olmaktadır. Özellikle kromojen aşamasından önce ki yıkmanın çok iyi yapılması gereklidir.